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養(yǎng)殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒

更新時間:2024-12-23 作者:氣象百科

養(yǎng)殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒

養(yǎng)殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒(柱膜法)使用說明書

【產(chǎn)品名稱】通用名稱:病毒DNA提取試劑盒

英文名稱:Extraction Kit for Virus DNA

【預(yù)期用途】本試劑盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、組織、飼料及環(huán)境中的病毒DNA的提取,純化的核酸可適用于各種常規(guī)操作及PCR試驗。

【試劑盒組分】

I、試劑盒組成及貯藏條件 名稱 20T 50T

1、吸附柱 20個 50個 2、收集管 20個 50個 3、裂解液 5mL11mL4、洗液I13mL32mL5,洗液II13mL32mL6.洗脫液1.2mL3mL

2、保存條件及有效期:室溫下保存,有效期12個月.

3、需自備材料:無水乙醇、1.5mL無菌離心管、1.5mL無菌離心管(長臂型)、生理鹽水、研缽、無菌1mL,2OOuL、10uL槍頭、記號筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備

1、血液樣品:抗凝血樣品置離心管中,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,取上層血漿;非抗凝血樣品置離心管中,待凝固后,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,取上層血清,置于滅菌離心管中,編號待檢。

2、組織樣品:采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品0.1g.組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨,加入1mL生理鹽水混勻,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,取上清于滅菌離心骨中,編號待檢。

3、口腔液:進食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉線綁紗布團吸引動物咀嚼,收集口腔液大于500uL,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,取上清于滅菌離心管中,編號待檢。

4、飼料:取適量研磨后的飼料(約0.2g),放入含1mL生理鹽水或PBS(PH為7.4)緩沖液的2mLEP管屮,振蕩混勻,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,取上清于滅菌離心管中,編號待檢.

5、灰塵:用無菌棉簽蘸取適量環(huán)境表面上的灰塵,放入含1mL生理鹽水或PBS(PH為7.4)緩沖液的2mLEP管中,振蕩混勻,8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘,取上清于滅菌離心管中,編號待檢。

二、DNA的提取

1、取裂解液200uL加入無核酸酶1.5mL離心曾屮,分別加入血漿/血清/組織液等樣品液200uL.震蕩混勻10秒或顛倒混勻10次,室溫放置5分鐘(如果室內(nèi)溫度較低時.需放置25C水浴溫育),再加入200uL無水乙醇,顛倒混勻10秒;若樣品渾濁則先12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘處理,取上清液,以避免堵塞柱子;

2、將液體轉(zhuǎn)入套有收集管的吸附柱中,12000rpm離心1分鐘:

3、棄收集管液體,向吸附柱中加600uL洗液I,12000rpm離心1分鐘;

4、棄收集管液體,向吸附柱中加600uL洗液II,12000rpm離心I分鐘;

5、棄收集管液體,12000rpm離心2分鐘,以徹底去除殘留洗液;

6、將吸附柱轉(zhuǎn)入新的無核酸酸1.5mLEP管(長臂型)中,向柱中央滴加50uL洗脫液,靜置1分鐘,12000rpm離心1分鐘,EP管中液體即為病毒DNA。

【注意事項】1、實驗前諾仔細閱讀本試劑盒說明書,嚴格按照操作步驟執(zhí)行.在操作過程中對時間、試劑體積等粘確控制可以獲得最好的結(jié)果

2,樣本應(yīng)新鮮采集使用,或低溫運輸儲存;

3,樣本具有潛在感染風(fēng)險,核酸的提取應(yīng)在核酸提取實驗室的生物安全柜中進行。

4、核酸提取冇關(guān)耗材確保高溫滅菌,提取后核酸盡快進入下一步試驗或冷凍保存待用。

5,試劑使用前應(yīng)混合均勻,試劑具有一定腐蝕性,使用時請戴手套、口罩做好防護。

6.低溫下裂解液出現(xiàn)結(jié)晶數(shù)屬正常現(xiàn)象,可在60°C水浴加熱助溶后使用。

7、實驗產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集,遠離PCR實驗室進行無害化處理。

僅供獸醫(yī)診斷使用

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書【獸藥名稱】

通用名稱:非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英文名稱:African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名稱:無

【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:試劑盒組分含量,陽性對照250μL/管×1管,陰性對照250μL/管×1管,PCR反應(yīng)液850μL/管×1管,萌混合液150μL/管×1管,說明書1份/盒

【作用與用途】本試劑盒可用于血液、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。扁桃體、腎臟、肌肉、環(huán)境樣品等

【用法與判定】

1用法

1.1待檢樣品釆集、保存及運輸

1.1.1樣品釆集

(1)活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL

(2)病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品,無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

(3)病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。

1.1.2樣品保存

采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過24小時,-70°C條件下保存,避免反復(fù)凍融。

1.1.3樣品運輸

泡沫箱加冰袋后密封進行運輸。包裝和運輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動物病原微生物菌(毒)種或者樣品運輸包裝規(guī)范》和交通運輸部門關(guān)于危險品運輸管理的有關(guān)規(guī)定。

1.2樣品處理

1.2.1血液樣品處理

抗凝血樣品置于離心管中,8000r/min離心2分鐘取上層血漿,編號待檢。非抗凝血樣品置于離心管中,待凝固后,8000r/min離心2分鐘取200μL上層血清,編號待檢。

1.2.2組織樣品處理

取適量脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等組織,置于研磨器或研磨管中研磨,再加適量生理鹽水混勻,制成約10%的組織勻漿,8000r/min離心2分鐘,取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中,編號備用。

1.2.3環(huán)境樣品處理

1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法

取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻,制成約10%的勻漿液.8000r/min離心2分鐘,取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心管中,編號備用。

1.2.3.2污水樣品處理方法

直接取200μL污水進行核酸提取。

1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進行DNA核酸提取。

1.4熒光PCR反應(yīng):

1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、酶混合液,室溫融化后,2000r/min離心5秒。設(shè)被檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應(yīng)體系配制如下:

試劑體系

PCR 反應(yīng)液17× (n+1) μL

酶混合液3× (n+1) μL

1.4.2在新的RNase/DNase-fire1.5mL離心管中加入上述試劑,充分混勻后瞬時離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管,蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋,混勻后瞬時離心,轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中,在熒光PCR儀上運行以下程序:

步驟 條件 循環(huán)數(shù) UNG處理 50℃,2分鐘1 預(yù)變性 95℃,3分鐘1 預(yù)擴增 95℃:8秒55℃:8秒5 PCR擴増 95℃:8秒55℃:8秒40

熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環(huán)的55℃時采集熒光信號。設(shè)置擴增體系為25μL,同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。(注:若熒光PCR儀(如AB17500)按說明 書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時間短無法運行,可將預(yù)擴增和PCR擴增條件變更為95C:5秒55°C:30秒)

2結(jié)果判定

2.1試驗有效性判定

陽性對照有典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線,線形為直線或輕微斜線,無指數(shù)增長期。則判試驗結(jié)果有效。否則,此次試驗視為無效。

2.2樣品判定

2.2.1陽性:樣本檢測結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長期,判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。

2.2.2可疑:樣本檢測結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對樣本進行重復(fù)檢測,如果重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi),有明顯指數(shù)增長期.則判定為陽性,否則為陰性。

2.2.3陰性:樣本檢測結(jié)果Ct值>38或無Ct值,判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。

【注意事項】(1)實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書,嚴格按照操作步驟執(zhí)行,在操作過程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得最好的結(jié)果。

(2)實驗室應(yīng)嚴格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理,依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴增區(qū)-分析區(qū)順序進行基因檢測。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴格要求。

(3)核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速,完成后進入下一步實驗或凍保。

(4)對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋,對于底部采光儀

器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底,檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。

(5)凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下完全融化,瞬時離心使液體完全沉于管底。避免反復(fù)凍融,以免影響試劑性能。

(6)樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋,.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。

(7)擴增產(chǎn)物禁止開蓋,實驗產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集,遠離PCR實驗室進行無害化處理。

【規(guī)格】50頭份/盒

【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存,有效期12個月。

【批準文號】獸藥生字163668871

僅供獸醫(yī)診斷使用


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